色情直播 Big Panel Theory 系列之—32色东说念主PBMC拓展分型决策（包含趋化因子受体、细胞因子和四聚体等）
免疫细胞表征是提高咱们对免疫学默契的尽头伏击的工夫之一，其中，同期分析归拢细胞的细胞表型和抗原特异性功能反馈是很有价值的，一方面不错已矣更全面的免疫细胞举止解读色情直播，另一方面也可最大戒指地从珍稀的样本中得回尽可能多的信息。
流式细胞术是免疫细胞表征尽头伏击的器具。早期的检测受决策大小的局限，要么荟萃检测免疫表型，要么仅专注于功能检测。连年来，跟着全光谱流式细胞术的发展，跳动30多个符号的决策变得容易，更高档的概括分析成为可能。
来自荷兰莱顿大学医学中心传染病的接洽小组，基于Cytek® 全光谱流式系统，开发了32色东说念主PBMC拓展分型决策，秘籍细胞名义标记物、趋化因子受体、MHC-肽四聚体和细胞内细胞因子等检测符号。该决策不详对细胞表型和评估免疫反馈质地的符号进行概括分析，有助于对免疫系管辖悟的提高。
接洽圭臬
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32色决策包括23个主要细胞亚群的表型符号，以及9个评估HLA-E特异性T细胞互相作用和细胞因子产生的符号（表1）。决策优化所触及的如抗体滴定、参比对照优化、自觉荧光创新以及添加Brilliant Stain染料缓冲液和True-Stain单核细胞阻断剂等操作，均参考OMIP-069进行。
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表1-32色决策中包含的符号及意旨
染色好的样本在Cytek® Aurora全光谱流式细胞仪上获取，获取数据用FlowJo v10.8.0和OMIQ分析软件（www.omiq.ai）进行分析。接洽者保举的染色经由如下图1所示（图1）。
图1 - 检测趋化因子受体、四聚体和细胞内细胞因子的
最好责任经由
接洽扫尾
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1. 对于趋化因子、四聚体和胞内因子染色
趋化因子：测试4℃ vs 37℃下趋化因子受体的染色遵守，发目下37°C下，对趋化因子受体CCR2、CCR4、CCR6、CCR7和CXCR3进行染色可改善信号，清晰为阳性信号的智谋度和分离度得到提高；而CX3CR1抒发水平受温度影响有限（图2A）。
四聚体：图2B上行所示为染色轨则对四聚体（TM）染色性能的影响，当CCR和TM一齐孵育（CCRs+TM），或TM染色后进行CCR染色（1TM， 2CCRs），与仅TM染色比拟（TM only），TM信号彰着丢失；先对CCR进行染色，然后进行TM染色（1CCRS， 2TM），与最好的“仅TM”信号比拟，检测智谋度相通。图2B下行所示为染色轨则对CCR4染色性能的影响，与仅CCR染色比拟（CCR only），在TM染色后CCR染色时（1TM， 2CCRs），不雅察到总CCR4群体的变化，而在TM染色之前进行CCR染色时（1CCRS， 2TM）未不雅察到。在TM染色之前进行CCR染色时，其他CCR也不雅察到与访佛的清晰（图2C），趋化因子受体或四聚体的信号莫得丢失，因此，将其（1CCRS， 2TM）笃信为最好染色轨则。
图2 - 测试趋化因子受体、四聚体和细胞因子的染色要求和组合
胞内细胞因子：将细胞内IFN-γ和TNF-α染色与TM染色相鸠合（TM+ICS），并将这些标记物的性能与仅使用TM（TM only）或仅细胞内细胞因子检测染色（ICS only）进行比较（图2D）。四聚体阳性细胞的比例在TM only（0.41%）和TM+ICS时（0.40%）保抓不变（图2D上行）。对于测试的两种细胞因子，与不使用TM染色比拟，在细胞内染色之前进行四聚体染色时，莫得不雅察到信号或细胞比例亏空。讲解，高或低比例的细胞因子，在与低比例四聚体阳性细胞组合的情况下，均可被检测到，且不管是胞内细胞因子依然TM，其染色性能均不受共染色的影响。
2. 32色决策的性能清晰
手动设门和无监督聚类分析的数据分别显现于图3和图4。在排斥不轨则事件、双细胞和死细胞后，按设门逻辑治安别离出单核细胞（经典、非经典和中间）和淋巴细胞，后者把柄抒发符号进一步进行类别和功能亚群细分，设门逻辑和详备分群情况可参考原文。（图3）
图3 - 32色决策手动设门政策
通过UMAP降维和FlowSOM无监督聚类圭臬，使用OMIQ软件可视化统共主要细胞亚群，主要分为CD4+ 细胞（细胞簇1-8） ，CD8+ 细胞（细胞簇9-15）， TCRγδ+ T细胞 （细胞簇16）， NK 细胞（细胞簇17），B细胞（细胞簇18-19），及单核细胞（细胞簇20-23）。图4C在聚类热图中展示了这些主要细胞亚群的符号抒发情况。（图4）
图4-通过UMAP和FlowSOM进行的高维数据分析
结 论
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荷兰接洽者开发的32色东说念主PBMC拓展分型决策，包括细胞名义符号，趋化因子受体，以及功能联系的四聚体和细胞因子符号。允许在归拢个样本中，进行主要细胞亚群的识别，并同期武断抗原特异性和细胞因子。接洽者合计，对于免疫细胞库的接洽，这么的决策长短常实用的，将有助于扩大咱们对疾病现象、挽救遵守或疫苗带领反馈的默契。
参考文件：
van Wolfswinkel， Marjolein， et al. "Extensive flow cytometric immunophenotyping of human PBMC incorporating detection of chemokine receptors色情直播， cytokines and tetramers." Cytometry Part A (2023).